研究背景

尽管在手术、放疗和分子靶向治疗方面取得了进展，非小细胞肺癌的死亡率仍然很高。针对程序性细胞死亡蛋白配体1pl1程序性细胞死亡蛋白1p1轴的iis通过激活细胞毒性细胞活性来促进肿瘤细胞的杀伤。虽然这些抑制剂已经被批准用于晚期nsl的治疗，但由于肿瘤微环境e中存在多种免疫抑制屏障，大多数患者几乎没有临床获益。因此，迫切需要努力寻找能够克服这些屏障，提高iis疗效的免疫调节剂。r具有潜在的免疫调节特性，因为它可以触发免疫原性细胞死亡和激活抗原提呈细胞，使肿瘤特异性细胞交叉激活，不仅可以限制原发肿瘤的生长，还可以产生针对远处非内窥镜转移灶的全身性效应。不幸的是，最佳的r剂量和潜在的分子机制取决于癌症的类型，对于非小细胞肺癌，包括诱导最佳免疫调节的测序和剂量/分割方案，目前还知之甚少。新出现的证据支持iis和r联合治疗包括nsl在内的各种肿瘤类型的可能性。一项i期试验显示，以前接受过放射治疗的nsl患者在接受iis治疗的情况下比没有接受过r治疗的患者有更长的无进展生存期。然而，由于之前的试验缺乏确定的分子机制，目前的临床试验测试这种组合是由经验选择指导的，而这些选择可能并不是最优的。在这里，我们提供了机械性的见解，可能会加速非小细胞肺癌r和iis联合治疗的发展。

技术路线

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研究结果

特定剂量的r可增强p1阻滞剂的疗效

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在正在进行的人类和鼠肿瘤的研究中，已经报道了不同剂量的低分割r，并提出了剂量和分割的关键重要性。因此，我们首先优化了微计算机断层扫描引导下的hkp1荷瘤肺r方案，该方案可以提高p1抑制的治疗效果。我们测试了一种先前报道在乳腺癌模型中具有免疫调节活性的r方案：8gy连续3天8gyx3，以及两种较低剂量的方案，4gyx3和05gyx3图1a。值得注意的是，4gyx34gyr联合p1抗体可显著控制肿瘤图1b，并提高存活率图1。此外，40的小鼠无瘤存活，而仅接受p1抗体治疗的队列小鼠的无瘤存活率为10。与单独抑制p1相比，05gyx3和8gyx3的其他剂量联合p1抑制并不能显著控制肿瘤或提高生存率图1e，f。

通过联合治疗获得持久的细胞活性

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为了阐明不同放疗剂量的不同影响，我们在最后一次放疗后1放疗开始后第4天检测了细胞浸润和细胞因子的产生。在所有被检查的队列中，4gyr显示在肿瘤胰岛浸润的8细胞数量最多图2a和扩展数据图1a，在hkp1肺中干扰素/肿瘤坏死因子/4细胞和gzb/8细胞数量最多图2b，和扩展数据图1b。这些4gyr诱导的细胞活性与其抑制p1的协同作用是一致的。越来越多的细胞被招募到hkp1肺部，逐渐获得功能障碍的表型，表现为4细胞的效应细胞因子表达减少，如干扰素和肿瘤坏死因子扩展数据图2a，b。为了确定4gyr是否增强了原有细胞的功能，我们用s1p受体抑制剂fy720治疗hkp1小鼠，fy720可以阻止活化的细胞从淋巴结流出扩展数据图2。正如预期的那样，fy720治疗通过减少循环细胞扩展数据图2，将4gyr的效果局限于肺部原有的细胞。与对照组相比，fy720取消了4gyr增加干扰素/肿瘤坏死因子/4细胞和gzb/8细胞的能力扩展数据图2e。因此，在fy720处理的小鼠中，4gyr和抗p1联合治疗的效果被取消扩展数据图2f。这些发现表明，4gyr并不能重新激活e中原有的功能紊乱的细胞。

4gyr治疗可激活e中的肺驻留棒状细胞

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为了探索4gyr诱导抗肿瘤免疫反应的机制，我们检测了r诱导的树突状细胞的激活。4gyr治疗既没有引起肿瘤细胞死亡扩展数据图4a，也没有增加支气管淋巴结中103交叉呈递的扩展数据图4b。接下来，我们对接受r0gy、4gy或8gyx3联合igg或p1抗体治疗的hkp1肺进行rnaseq分析。比较4gyr组、0gy模拟组和8gyr无效剂量组在抗p1治疗前后的差异表达基因p≈ap;l;001，倍增2和最小二乘平均5。通过将igg队列中4gyr上调的基因与抗p1队列重叠，我们识别了144个特定于该有效辐射剂量上调的基因图3a和扩展数据图5a。为了确定这4个gyr特征基因的细胞来源，我们对接受0gy或4gyr的hkp1荷瘤肺进行了单细胞rnaseqsaseq分析。通过将144个签名基因投影到分布随机邻居嵌入sne图，我们发现这些基因在4gyr后在气道上皮/棒状细胞簇中显著上调图3b。

棒状细胞分泌体与联合治疗的疗效有关

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无论采用哪种耗竭方法，携带hkp1的肺对4gyr的免疫反应均明显减弱，表现为细胞向肿瘤胰岛的浸润显著减弱，效应细胞因子的产生减少4细胞中的干扰素/肿瘤坏死因子和8细胞中的gzb图4和扩展数据图6。值得注意的是，在hkp1荷瘤小鼠中，棒状细胞缺陷取消了联合治疗的疗效图4。

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电子显微镜对棒状细胞的进一步表征显示，与对照组相比，从4gyr治疗的肺中分离出的棒状细胞中分泌囊泡的数量增加扩展数据图8a，b。我们推测放疗后棒状细胞的分泌可能在提高iis疗效中起作用。为了解决这个问题，我们使用sgb1a1reer/snap23flx/flx转基因小鼠简称sgb1a1re/snap23fl/fl阻止棒状细胞分泌蛋白进入肺e。突触体相关蛋白23snap23是snare复合体的关键成分，它介导细胞内囊泡融合到膜上，调节胞吐。他莫昔芬治疗sgb1a1re/snap23fl/fl小鼠允许有条件的棒状细胞特异性缺失snap23基因图5a，而不改变细支气管的完整性扩展数据图8。对支气管肺泡灌洗液balf的分析证实，与野生型对照相比，4gyr治疗的sgb1a1re/snap23fl/fl小鼠的棒状细胞分泌组成10显著减少图5b。与棒状细胞消融一致，snap23缺乏抑制了hkp1肺对4gyr反应中细胞的浸润和激活图5和扩展数据图8。

棒状细胞减少促肿瘤炎症

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球状细胞缺陷治疗小鼠的肺显示髓系/淋巴细胞比率增加ye/ly，对照组和治疗小鼠分别为096和134，图6a。此外，杆状细胞缺陷肺中的髓样细胞表现出炎症介质的表达增加，如il1b、pgs2和nf图6b，据报道它们可以抑制适应性抗肿瘤免疫。我们推测这些棒状细胞介导的e改变可能影响了细胞效应器的表型。使用基于图形的分类，细胞被分成9个簇图6，每个簇的功能状态根据它们的特征基因来确定图6和补充表2。我们观察到效应细胞簇5显示细胞因子、效应分子干扰素和肿瘤坏死因子和细胞活化标志物p1和表达增加，增殖细胞簇9显示颗粒酶和ki67表达，调节性细胞簇8显示fxp3和il2ra表达图6。值得注意的是，与对照组分别为263和196相比，去杆状细胞治疗降低了效应器、增殖细胞和reg细胞的比率59/8。总之，这些saseq结果表明，r激活的棒状细胞的存在有助于适应性抗肿瘤免疫，可能是通过限制hkp1肿瘤中髓系细胞介导的炎症。balf样本的elisa检测显示，与0gy对照组相比，4gyr显著降低了hkp1e中il1、pge2和nf的水平图6，但在没有棒状细胞处理的sgb1a1re/ir或其分泌体sgb1a1re/snap23fl/fl的情况下，4gyr未能减少这些炎症因子图6。为了证明r诱导的棒状细胞分泌体的临床相关性，我们在ii期新辅助临床试验n0290495454中评估了接受r联合iis抗pl1治疗的nsl患者的血浆水平。分别于首次立体定向全身放射治疗sbr前1和末次sbr后1采集血浆。匹配患者10血浆浓度比较放疗前和放疗后显示，大多数获得病理改善的患者在放疗后血10水平升高8人中有5人，而无反应的患者9人中有0人，p00301图6e，表明棒状细胞激活与联合治疗的病理反应有关。综上所述，这些发现表明，r激活的棒状细胞通过其分泌体抑制了hkp1肺中的肿瘤前炎症，从而增强了适应性抗肿瘤免疫。

棒状细胞因子改善p1受体阻滞剂的疗效

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这些体外研究结果促使我们研究棒状鸡尾酒是否能反映4gyr在改善体内p1阻断方面的效果。我们每天给hkp1小鼠鼻内注射棒状鸡尾酒每只小鼠每只蛋白20ng，连续3第1113天，并联合p1抗体图8a。值得注意的是，与模拟对照相比，联合p1抗体的棒状鸡尾酒治疗可显著控制肿瘤并提高hkp1小鼠的存活率图8b，。与4gyr相似，支气管肺泡灌洗液分析显示，与对照组相比，棒状鸡尾酒治疗组小鼠的肿瘤坏死因子、前列腺素e2和il1水平较低图8。最后，为了确定棒状鸡尾酒和p1抗体联合治疗是否能产生持久的抗肿瘤免疫，我们进行了肿瘤再攻击实验。事实上，与对照组相比，存活的小鼠在35天内清除了肺部的肿瘤细胞扩展数据图10e。总之，这些发现表明，棒状细胞分泌蛋白通过抑制免疫抑制的ss和增强细胞功能来提高p1阻断的疗效。

研究小结

在nsl模型中，确定了一种特定剂量的r，当与iis联合使用时，该剂量可使肿瘤消退并提高存活率。

r的免疫调节作用归因于激活的肺居留sgb1a1棒状细胞。值得注意的是，具有棒状细胞特异性突触体相关蛋白23基因敲除的小鼠未能从联合治疗中受益，这表明棒状细胞分泌体起着关键作用。

我们鉴定了八种棒状细胞分泌蛋白，它们可以抑制免疫抑制的髓样细胞，减少肿瘤前炎症，增强抗肿瘤免疫。值得注意的是，联合治疗后nsl患者血浆中棒状细胞分泌组成10水平升高。

讨论

我们的观察结果与主流观点一致，即r联合iis可引起抗肿瘤反应。值得注意的是，我们的研究提供了一种机制，通过辐射诱导驻肺的sgb1a1棒状细胞分泌增强iis对非小细胞肺癌的治疗效果。越来越多的证据表明，与促癌炎症相关的免疫抑制微环境构成了癌症免疫治疗成功的主要障碍，并提出了以炎症为靶点来提高iis疗效的建议。与已报道的棒状细胞在过敏、哮喘和p中的抗炎作用一致，我们展示了r激活的棒状细胞分泌蛋白在非小细胞肺癌中的耐人寻味的作用，它可以对抗多种免疫抑制介质，增强适应性抗肿瘤免疫。从我们的研究中得到的见解在临床翻译中具有显著的潜力。目前，由于特定物种的辐射敏感性和靶区体积的差异，目前缺乏将放射剂量从动物模型转换到人类以及反之亦然的标准。然而，我们的研究表明，未来的人类非小细胞肺癌临床试验应该考虑优化一种能有效介导肺部常驻棒状细胞激活的放射治疗剂量。目前，缺乏在不损害肺上皮完整性的情况下激活棒状细胞的药理学或遗传学方法。证明给予棒状细胞鸡尾酒增强了iis的疗效，在开发这些因素作为非小细胞肺癌的治疗方式方面具有巨大的潜力。进一步的研究需要确定能够产生强有力的治疗效果的分泌因子的最佳组成。值得注意的是，sbr提高了对新辅助sbriis治疗有反应的nsl患者10水平，这一发现表明，r诱导的血浆中的棒状细胞分泌因子可能有可能作为对sbr/iis治疗有反应/无反应的非侵入性生物标志物。总之，来自我们研究的见解有可能为未来的临床试验提供指导，使放射和免疫治疗组合的有效性最大化，以提高病理应答率和改善非小细胞肺癌患者的存活率。

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